项目成果简介：1.解决海水鱼类细胞培养中的三个关键技术：

①.原代培养材料的消毒处理技术，克服原代培养中细胞易污染的难题；

②.海水鱼类单细胞悬液制备技术，提高原代细胞培养的成活率；

③.鱼类细胞系的永生性转化技术，使原代培养的细胞系可以大量转化为永生细胞系。

从而为推动鱼类分子生物学.免疫学.病毒学和遗传育种等研究的发展，提供有效的实验工具。

2.建立半滑舌鳎的永生性细胞系1～2个。

3.设计.研制一种海水鱼类细胞专用培养基。

项目背景：半滑舌鳎的市场价格高，又因其肉质细腻鲜美，生长速度快，而成为当前养殖的热门新兴鱼种。建立半滑舌鳎的细胞系，可以为今后人工养殖半滑舌鳎的病毒检测和疫苗制备等提供有效的敏感的细胞株，为半滑舌鳎的健康养殖提供有力的技术保证，具有潜在的巨大的经济效益。而这一成果的实现主要是靠解决关键技术难题，建立一套成熟的海水鱼类细胞建系技术来实现的。具体的体现在：

①.原代培养材料的消毒处理技术的成熟与完善，可以使鱼类原代培养的成功率大大提高，消除原代培养物中的原生动物污染.细菌污染.酵母污染和霉菌污染的可能性。

②.海水鱼类单细胞悬液制备技术的形成：主要是针对鱼类各组织，优化其酶解消化条件，包括胰蛋白酶和胶原酶（单酶或双酶）的消化浓度和作用时间，从而进一步提高原代细胞培养的成活率

③.鱼类细胞系的永生性转化技术的程序化：使原代培养的细胞系可以转化为永生性细胞系，从而节省了原代培养所需要耗费的大量的人力.物力和财力。并为海水鱼类细胞在病 毒检测.疫苗生产和病理毒理等方面的应用，准备好实验材料，其意义重大。

关键技术和创新点：1.海水过滤.煮沸.消毒 ；消毒海水漂洗活鱼多次 。将漂洗干净的活鱼移入含高浓度抗生素的消毒海水中暂养24h以上， 无菌室中取出活鱼，75%酒精擦拭消毒取材部位或解剖部位， 超净工作台内取材。

2.海水鱼类单细胞悬液制备技术：锋利眼科剪刀将组织块剪碎成约1mm³的小块 ，PBS漂洗2-3次，去血污， 优化酶解消化条件，包括胰蛋白酶和胶原酶（单酶或双酶）消化的浓度和作用时间 ，使消化后的细胞和组织块混合物挤过前端带细金属网的注射器 ，细胞悬液离心，1000转/分，5-10分钟， 鱼类细胞培养基重悬细胞沉淀， 接种到培养瓶。

3.海水鱼类细胞专用培养基的设计：分析比较在鱼类细胞培养中应用效果较好的几种哺乳动物培养基如Leibovitz's L-15.DMEM和MEM等的基础上，设计一个添加NaCl的盐度适宜.渗透压适宜的人工合成鱼类细胞专用培养基。该培养基在使用前添加适量的鲤鱼或草鱼血清以及小牛血清，成为适于大多数海水鱼类细胞生长的生长培养基，提高海水鱼类细胞建系的成功率。

4.鱼类细胞系的永生性转化技术：紫外线照射处理体外培养鱼类细胞， 诱导细胞生长调控基因，其目的是诱导细胞生长调控基因如p53发生突变，然后恢复正常培养条件，从而筛选永生性转化鱼类细胞 ，继续克隆培养，以得到永生性鱼类细胞系。

项目技术水平和创新程度。

①.适合海水鱼类细胞培养的专用培养基，是国内乃至国际领先的技术和成果

②.建立的半滑舌鳎永生细胞系填补了国际上在此领域的空白。

③.本课题拟解决的四个关键问题，都是国内首创。